成功轉(zhuǎn)染**步：細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
細(xì)胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當(dāng)然挑個容易做的。越是接近體內(nèi)的真實情況的原代細(xì)胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細(xì)胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細(xì)胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時一些啟動子在不同的細(xì)胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計實驗時需要考慮的因素，姑且不論。不過因為受限于特定的細(xì)胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因為不同的細(xì)胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實驗室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細(xì)胞株，好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，看看其中是否有你的新對手——這個FuGENE 6 比較有優(yōu)勢，已有750多種細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。聚焦轉(zhuǎn)染專輯里面也一一列出查閱各主流轉(zhuǎn)染試劑相關(guān)數(shù)據(jù)的網(wǎng)址。當(dāng)然這只是參考而已，細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。
當(dāng)實驗進(jìn)行到轉(zhuǎn)染這一步時需要注意的因素有哪些呢?
一、健康而茁壯成長的細(xì)胞
轉(zhuǎn)染前細(xì)胞好經(jīng)過1—2次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎匯片時就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時，因為一旦長滿了，細(xì)胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦。活力充沛的年輕細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。
大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代不會馬上降低轉(zhuǎn)染效率)。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)佳結(jié)果。
二、恰到好處的鋪板密度
轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細(xì)胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，好能夠進(jìn)行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細(xì)胞密度為40%-80%，但這個需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書——陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細(xì)胞適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求佳的轉(zhuǎn)染效果。
不同的實驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。
三、溫暖舒適的培養(yǎng)基
健康的細(xì)胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充添加劑等等。如果是培養(yǎng)新手，可留意隨后的生物通細(xì)胞培養(yǎng)專輯，我們就不羅嗦了。還是專心介紹幾種添加劑在轉(zhuǎn)染過程中“影響因子”吧。
血清
血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，對于某些對血清要求敏感的細(xì)胞來說是個難題。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。對于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在會影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基來稀釋DNA 和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的 Lipofectamine2000，F(xiàn)uGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等(看看生物通前面的介紹吧)。厲害的是Qiagen的2個產(chǎn)品，Polyfect和 Effectene，全程都可以用有血清和***等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，包括稀釋步驟，不用擔(dān)心培養(yǎng)基的變化對細(xì)胞生長有什么**影響了。這樣，就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細(xì)胞，也就減少操作的復(fù)雜程度，更重要的是不必再讓細(xì)胞處于無血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染，不必?fù)?dān)心對血清缺乏很敏感的細(xì)胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細(xì)胞們，你們有福了。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。
***
支原體、**、**污染，無論對于細(xì)胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛”，可能會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會添加***來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些***一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使***可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以，對于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實驗，要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用***，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用***。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些***是GENETICIN選擇性***的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的***量。這里又要表揚(yáng) Qiagen的2個產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，因為全程都可以用有血清和***等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，很方便的。對于篩選穩(wěn)定表達(dá)株，要預(yù)留足夠的時間讓抗性基因表達(dá)后再添加篩選壓力。
其他添加物如***，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物的過程，要盡量避免。
成功轉(zhuǎn)染**步：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染
一、質(zhì)粒的構(gòu)建：啟動子的選擇
啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。
啟動子可分為2大類：誘導(dǎo)型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動子啊等等。
獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA- L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。
一個強(qiáng)悍的高表達(dá)組成型啟動子是我們做表達(dá)所求之不得的，但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好——因為任何持續(xù)過高表達(dá)外源基因都可能帶來某種程度的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞生長——如果外源基因本身對細(xì)胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了——因為過量表達(dá)本身可能已經(jīng)害死了那個轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞，沒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會不會是這個原因呢?過猶不及就是這個道理咯。
誘導(dǎo)型啟動子對于轉(zhuǎn)染來說，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達(dá)可以受到我們的調(diào)控——轉(zhuǎn)染的時候不表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)株后再誘導(dǎo)表達(dá)，使得表達(dá)有毒性的基因或者**分析表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動子在接受某種信號后“打開開關(guān)”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號后打開開關(guān)。Clontech還有個誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達(dá)開關(guān)可控，表達(dá)量多少也可以通過誘導(dǎo)劑的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動子很好玩——具有時序性或者組織特異性(空間特異性)，會受到特定的元件調(diào)控，在一定的時間或者特定組織細(xì)胞中表達(dá)的，比如那個轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動子——有人說這是組成型的，我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細(xì)胞中會有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問題主要是本底表達(dá)，表達(dá)量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對細(xì)胞的影響和如何**，不過這些都不關(guān)轉(zhuǎn)染的事，我們等生物通的表達(dá)專輯時再慢慢說吧。
轉(zhuǎn)染DNA的啟動子-增強(qiáng)子如果不被宿主細(xì)胞識別也會產(chǎn)生無法表達(dá)的“悲劇”，這是實驗設(shè)計時需要注意的問題。不過現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者模擬國外已經(jīng)成功的實驗的居多，獨(dú)立構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。
目的基因：這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會影響選定細(xì)胞株的生長，甚至有毒，那好選擇一個誘導(dǎo)型的啟動子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細(xì)胞有毒，所以正負(fù)對照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。
二、質(zhì)粒的大小和質(zhì)量 線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。
純化質(zhì)粒的質(zhì)量無疑會影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動物細(xì)胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。令人頭疼的是內(nèi)**了。內(nèi)**是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A(lipopolysaccharides)，在**被裂解時被釋放出來，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)**很容易混入質(zhì)粒DNA**同純化出來。內(nèi)**的存在會嚴(yán)重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)**可能會激活造血細(xì)胞(例如B細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等)的非特異**反應(yīng)，造成實驗中的假陽性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時應(yīng)盡量采用無內(nèi)**污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進(jìn)步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實驗室會選擇使用轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細(xì)胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對于一些對內(nèi)**特別敏感的細(xì)胞，就要用“去內(nèi)**”的質(zhì)粒純化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相當(dāng)于2次CsCl超速離心純度的質(zhì)粒，同時特別設(shè)計去除內(nèi)**，專為嬌氣的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染和體內(nèi)DNA疫苗而設(shè)計。此外現(xiàn)在Invitrogen和Stratagene都有一些快速純化質(zhì)粒同時也去內(nèi)**的Kit，使得去除質(zhì)粒中的內(nèi)**更為簡便(參考生物通質(zhì)粒純化專輯)。
質(zhì)粒DNA的濃度和量：既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。有的初學(xué)者習(xí)慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢?DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來說，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預(yù)實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的DNA。所以轉(zhuǎn)染前好能**定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素(比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動子強(qiáng)弱等因素)，單獨(dú)DNA也會對細(xì)胞生長有一個基礎(chǔ)的影響，所以同時做幾組不同量的對照實驗進(jìn)行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞鋪板密度較高時，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會略微提高。
