如何選擇高內(nèi)涵分析儀器

高內(nèi)涵分析(High Content Analysis，簡(jiǎn)稱HCA)是對(duì)高分辨率顯微鏡所拍攝細(xì)胞圖像的自動(dòng)提取和分析。市場(chǎng)上有三個(gè)類型的這種儀器：寬場(chǎng)熒光顯微鏡型高內(nèi)涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵。研究人員應(yīng)當(dāng)如何選擇呢?本文就給出大家一些建議以供參考。

高內(nèi)涵分析是對(duì)高分辨率顯微鏡所拍攝細(xì)胞圖像的自動(dòng)提取和分析。高內(nèi)涵，意味著豐富的信息。這些信息包括：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞圖像和各項(xiàng)指標(biāo)，細(xì)胞群體的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化，熒光信號(hào)空間分布的改變等等。人們往往因?yàn)樘囟ǖ膯?wèn)題去設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在圖像中找到答案的同時(shí)，其他的信息會(huì)帶來(lái)意外的新發(fā)現(xiàn)。

論文中單幅熒光顯微圖像通常顯示的是陽(yáng)性目標(biāo)的有或無(wú)，強(qiáng)或弱，是定性分析。而高內(nèi)涵技術(shù)的研究對(duì)象不是一個(gè)或少數(shù)細(xì)胞，而是對(duì)大量細(xì)胞的同時(shí)觀察和分析，從大量圖像中得到細(xì)胞群體的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)論更有科學(xué)說(shuō)服力。因?yàn)榉治龅膶?duì)象是完整的細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以同時(shí)使用多種熒光探針，大量細(xì)胞的多參數(shù)同時(shí)分析有助于更深入地理解復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)機(jī)理和相互作用。

此外，高內(nèi)涵技術(shù)還有助于人為偏差的消除。人們往往會(huì)選擇比較好的細(xì)胞來(lái)拍攝和分析，而機(jī)器是客觀的，所有樣品的成像分析條件是完全相同的。高內(nèi)涵分析可在培養(yǎng)細(xì)胞、組織切片甚至3D培養(yǎng)上開(kāi)展。它有著廣泛的應(yīng)用，如**篩選、多參數(shù)功能研究、化學(xué)基因組學(xué)、靶標(biāo)驗(yàn)證和毒性檢測(cè)等。

高內(nèi)涵技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高速顯微成像，以前耗時(shí)費(fèi)力的工作瞬間完成，研究人員可綜合海量信息更快做出決策。在**靶標(biāo)的確認(rèn)、化合物的藥理和毒性篩選上，高內(nèi)涵分析優(yōu)勢(shì)明顯，而對(duì)于復(fù)雜細(xì)胞學(xué)機(jī)理的研究，HCA所提供的有價(jià)值的信息可以幫助研究人員在日益激烈的科研競(jìng)賽中勝出。

經(jīng)過(guò)這些年的發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多高內(nèi)涵儀器(如下表)，這些儀器可以分為三大類：寬場(chǎng)熒光顯微鏡型高內(nèi)涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵。

表1. 各種類型的高內(nèi)涵儀器舉例

激光掃描型高內(nèi)涵是以激光作為熒光光源，用PMT采集光信號(hào)，通過(guò)預(yù)設(shè)間距點(diǎn)掃描獲得數(shù)據(jù)，沒(méi)有成像的過(guò)程，速度快是其大的優(yōu)勢(shì)。但這類儀器的局限性是分辨率不高，只能提供虛擬圖像。X軸的分辨率是以預(yù)設(shè)的間隔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um)設(shè)定的，而Y軸是用戶自行設(shè)定的，一般在1到10 um。由于不是基于圖像的分析，分析軟件相對(duì)簡(jiǎn)單，適合于比較成熟簡(jiǎn)單的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。所以被很多**研發(fā)企業(yè)作為初篩平臺(tái)。

而基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜，很多時(shí)候需要在亞細(xì)胞水平對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)清晰成像，檢測(cè)的指標(biāo)也復(fù)雜多樣，需要非常強(qiáng)大的圖像分析軟件來(lái)設(shè)定，所以顯微鏡型的高內(nèi)涵更適合科學(xué)研究的需要，**研發(fā)機(jī)構(gòu)在復(fù)雜的篩選實(shí)驗(yàn)也會(huì)考慮使用顯微鏡型高內(nèi)涵儀器。

在選擇高內(nèi)涵儀器時(shí)主要考慮三個(gè)方面：成像速度、成像質(zhì)量和圖像分析軟件功能是否強(qiáng)大。

1.成像速度

高內(nèi)涵儀器是在顯微鏡的基礎(chǔ)上搭建的高速顯微成像的平臺(tái)，從所得圖像中抽出一張和普通顯微鏡拍攝的圖像沒(méi)有區(qū)別，也就是說(shuō)，寬場(chǎng)熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是寬場(chǎng)熒光顯微圖像，而共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是共聚焦質(zhì)量的圖像。

高內(nèi)涵儀器和普通顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于成像速度極大提高。如果每個(gè)孔取一個(gè)視野，雙色熒光，Hoechst染細(xì)胞核，EGFP標(biāo)記細(xì)胞器，硬件自動(dòng)聚焦，GE Healthcare的IN Cell 2000可以在約3分鐘內(nèi)對(duì)整塊96孔板成像，在短短幾分鐘內(nèi)得到將近200張照片。IN Cell 2000能夠高速成像是因?yàn)椋?)明亮的光源，和顯微鏡以液體光導(dǎo)纖維相連，光的傳輸效率高，顯著縮短曝光時(shí)間;2)大芯片CCD相機(jī)可選擇，成像視野約是標(biāo)準(zhǔn)芯片相機(jī)成像視野的四倍，大芯片CCD相機(jī)一個(gè)視野就有可能捕捉到足夠的細(xì)胞用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，節(jié)省很多時(shí)間;3)在線細(xì)胞計(jì)數(shù)功能：微孔板各個(gè)孔中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)可能會(huì)不同，在線細(xì)胞計(jì)數(shù)針對(duì)不同的孔自動(dòng)調(diào)整拍攝視野數(shù)量，整體縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間;4)自動(dòng)聚焦：是提高成像速度的關(guān)鍵，IN Cell 2000提供基于激光的硬件自動(dòng)聚焦和基于圖像對(duì)比度的軟件自動(dòng)聚焦，二者可結(jié)合使用。

雖然寬場(chǎng)熒光顯微鏡型高內(nèi)涵比普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡成像速度快，共聚焦型高內(nèi)涵比共聚焦顯微鏡成像速度快，但共聚焦型高內(nèi)涵未必比普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡成像速度快，所以用戶須根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器。IN Cell 2000雖然不是共聚焦高內(nèi)涵，但其獨(dú)有的去卷積圖像復(fù)原功能可以顯著提高圖像的對(duì)比度和分辨率，提供可與共聚焦圖像媲美的高質(zhì)量的圖像。

2、圖像質(zhì)量和成像速度之間的平衡

科研用戶既希望成像速度快，又希望圖像質(zhì)量好，可以考慮GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光為光源的可變光闌線掃描共聚焦高內(nèi)涵儀器，擁有**的光學(xué)系統(tǒng)，成像完全可調(diào)：光闌完全打開(kāi)時(shí)成像速度快，完全共聚焦模式去除背景有效，光闌打開(kāi)的程度在1-3 AU之間可調(diào)，可以針對(duì)不同的需求調(diào)節(jié)共聚焦程度，達(dá)到成像速度和圖像質(zhì)量的優(yōu)化組合。IN Cell 6000感光成像采用550萬(wàn)像素新一代sCMOS相機(jī)，噪音比CCD相機(jī)低五倍，超高靈敏度并縮短曝光時(shí)間，比標(biāo)準(zhǔn)相機(jī)的視野大四倍。

3、圖像分析軟件

科研用戶檢測(cè)的指標(biāo)復(fù)雜多樣，除了基本的模塊式分析工具，還需要有更強(qiáng)大的分析軟件允許用戶自主定義分析程序。GE Healthcare的高內(nèi)涵平臺(tái)除了基本的分析工具，還提供IN Cell Developer Toolbox 客戶自定義分析軟件，可以分析各種實(shí)驗(yàn)的圖像結(jié)果。針對(duì)特定的實(shí)驗(yàn)，用戶使用一系列的圖像分析工具來(lái)編寫(xiě)自己的分析程序，包括：**區(qū)分(segmentation)工具，圖像處理工具，自定義測(cè)量值，宏子程序等。Developer Toolbox曾獲得2006年全球佳生物圖像分析軟件獎(jiǎng)(美國(guó)知名科學(xué)雜志《Scientific Computing》頒發(fā))。

Spotfire是一款用于科學(xué)數(shù)據(jù)分析的可視化分析平臺(tái)，其大的特點(diǎn)是通過(guò)多種動(dòng)態(tài)的圖形(點(diǎn)圖、線圖、柱狀圖、餅狀圖、熱圖等)和篩選條件，快速對(duì)大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，并可以做出報(bào)告或與他人分享結(jié)果，做出決策。支持多種客戶端界面和Web界面的訪問(wèn)和顯示。IN Cell 圖像分析軟件內(nèi)嵌和Spotfire DecisionSite Basic軟件連接的圖標(biāo)，輕松使用數(shù)據(jù)可視化分析工具。

IN Cell Miner HCM數(shù)據(jù)管理軟件以經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的 EMC Documentum 軟件為基礎(chǔ)，可以方便地注釋、建檔、檢索、存儲(chǔ)高內(nèi)涵圖像和數(shù)據(jù)。研究機(jī)構(gòu)的所有使用者可以分享和比較數(shù)據(jù)，大限度地挖掘和實(shí)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的價(jià)值?？焖僦谱鼍赖臄?shù)據(jù)圖，用于工作展示、技術(shù)交流和文章發(fā)表。