GTP酶研究新工具（二）

小GTP酶中的Ras超家族作為分子開關(guān)，控制了多個(gè)真核細(xì)胞行為，包括細(xì)胞生長、分化和運(yùn)動(dòng)。因此，小GTP酶參與了一些**狀態(tài)，如癌癥和代謝**。與GTP結(jié)合時(shí)，GTP酶激活，而與GDP結(jié)合時(shí)，GTP酶失活。

為研究GTP酶的激活，賽默飛世爾科技公司推出了Pierce Active GTPase Pull-down and Detection Kit，可優(yōu)先富集活性形式的GTP酶。這些試劑盒包含了GST-蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，分別是活性Rho、Ras、Rac1、Cdc42、Rap1、 Arf1或Arf6選擇性的。

活性小GTP酶很難檢測，因?yàn)槟壳斑€沒有此種形式對應(yīng)的一抗。為了克服這個(gè)問題，pull-down方法利用了特定GTP酶的活性形式與已知下游效應(yīng)蛋白的親和力。下游效應(yīng)蛋白的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)以GST融合蛋白的形式表達(dá)。當(dāng)固定在谷胱甘肽瓊脂糖樹脂上時(shí)，PBD將與細(xì)胞裂解液中活性GTP酶相結(jié)合。pull-down的活性GTP酶可通過Western Blotting檢測。

這種親和力提供了一種方法，從GTP酶的整體變化中區(qū)分瞬時(shí)上調(diào)或下調(diào)的活性GTP酶。這些瞬時(shí)的變化可能是因?yàn)榧?xì)胞暴露在細(xì)胞因子或其他小分子刺激物或抑制劑中，也可能是因?yàn)榧?xì)胞生長、分化、癌變和轉(zhuǎn)移中發(fā)生的變化。

作為對照，細(xì)胞裂解液可用GTPγS處理，這是一種GTP的非水解類似物。此方法能捕獲所有活性形式的GTP酶，實(shí)現(xiàn)GTP酶的大量富集。同時(shí)，細(xì)胞裂解液可用過量GDP處理，將大部分GTP酶轉(zhuǎn)變成非活性狀態(tài)，來作為陰性對照。

試劑盒經(jīng)過功能驗(yàn)證，與小鼠、大鼠和人的多種細(xì)胞類型兼容，其中優(yōu)化的試劑、特異抗體和western blot的步驟確保了準(zhǔn)確的控制和半定量的結(jié)果。此外，您無需自己表達(dá)和純化GST-PBD融合蛋白，也無需使用昂貴的**沉淀親和樹脂。此試劑盒操作簡單，能在2小時(shí)內(nèi)完成。而微量離心柱能高效分離液體和樹脂，避免樣品損失和交叉污染。

該試劑盒包含了親和純化的試劑及對照，一個(gè)兼容的細(xì)胞裂解緩沖液，及終Western blot檢測的特異一抗，足夠開展30次pull-down。