論測序，華大基因算是國內(nèi)至Top的研究院，裝備精良，人才濟(jì)濟(jì)。2008年底，頭個(gè)亞洲人基因組出爐。這一研究成果公布在權(quán)威期刊《Nature》雜志上，文章的通訊作者和**作者正是來自深圳華大基因研究院的王俊博士。在這篇文章中，研究人員利用新一代測序儀Illumina Genome Analyzer完成了人基因組的測序，測序量達(dá)到36倍覆蓋率，并且研究人員還比對了NCBI人類相關(guān)基因組，短讀取序列達(dá)到99.97%覆蓋率。
記者：**個(gè)黃種人基因組圖譜的公布是我們的驕傲，相比較于水稻、家蠶、家雞、家豬等動(dòng)植物基因組圖譜，這個(gè)基因組圖譜的完成是否更困難一些?還是更容易一些，在這個(gè)基因組測定過程中是否遇到了一些技術(shù)困難?具體有哪些?
王俊博士：相較于水稻、家蠶、家雞、家豬等動(dòng)植物基因組圖譜而言，**個(gè)黃種人基因組圖譜的總體工作相對更加困難一些。我們在測定**個(gè)黃種人的時(shí)候采用了新一代測序儀 Illumina Genome Analyzer，雖然測序價(jià)格更便宜，測序速度更快，卻給數(shù)據(jù)的存儲、處理、分析、展示帶來了巨大的挑戰(zhàn)，尤其是面臨了現(xiàn)有的生物分析軟件無法解決的問題，例如測序數(shù)據(jù)量較大增長了序列比對的時(shí)間，測序序列平均讀長較短導(dǎo)致序列很難**定位，而針對這些困難我們獨(dú)立自主研發(fā)的軟件(SOAP、SOAPsnp)是我們完成這個(gè)項(xiàng)目時(shí)值得驕傲的地方之一。
記者：在基因組測定過程中主要采用的技術(shù)點(diǎn)有哪些?您認(rèn)為關(guān)鍵的一項(xiàng)技術(shù)是什么?
王俊博士：在基因組測定過程中主要的技術(shù)點(diǎn)是基因組測序和生物信息分析。我認(rèn)為關(guān)鍵的技術(shù)是生物信息分析，因?yàn)殡S著新一代測序技術(shù)的廣泛使用，測序的成本大大降低，測序速度有所提高，而測序過程也變得相對簡單容易，但是測序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)卻給后期的生物信息分析帶來了巨大的壓力，因此我認(rèn)為生物信息分析是在基因組測定過程中關(guān)鍵的一項(xiàng)技術(shù)。
世界**研究院Wellcome Trust Sanger研究院至少擁有37臺Illumina的Genome Analyzer，5臺ABI SOLiD和2臺454 GS FLX。但是他們也沒有完全拋棄毛細(xì)管方法，目前仍有50臺ABI 3730，用于斑馬魚和豬的基因組計(jì)劃。光是看這個(gè)數(shù)據(jù)，就已經(jīng)讓人咂舌了。當(dāng)然，從下面的訪談中你也可以看出，**的基因組中心和一般的實(shí)驗(yàn)室還真是不一樣，他們資金雄厚，站得高，看得遠(yuǎn)。因此他們的選購標(biāo)準(zhǔn)不適合普通實(shí)驗(yàn)室，僅作了解。
Q：你們選擇新平臺的標(biāo)準(zhǔn)是什么?
A：我們一定要站在前沿，無論代價(jià)是什么，我們都會(huì)做。我們經(jīng)常測試新儀器和現(xiàn)有儀器的新版本。我們要看到這項(xiàng)技術(shù)確實(shí)能產(chǎn)生合理量的準(zhǔn)確序列，才會(huì)進(jìn)行購買。但同時(shí)，我們還有開發(fā)資源的任務(wù)，因此我們對檢驗(yàn)新技術(shù)很有興趣，并且我們還能驗(yàn)證現(xiàn)有技術(shù)，它們對于其他實(shí)驗(yàn)室或許還不夠成熟。因?yàn)槲覀兿Ｍ驹跍y序的前沿，我們就要比小實(shí)驗(yàn)室跑得更快，它們的經(jīng)費(fèi)可能只夠買一臺儀器。同時(shí)，我們有義務(wù)與他人分享我們的經(jīng)驗(yàn)。
Q：你們有著何種數(shù)據(jù)儲存與分析硬件來支持測序儀?
A：我們的計(jì)算機(jī)設(shè)備特地為支持新一代測序而剛剛更新過。我們有320 TB的文件服務(wù)器來短期存儲圖像和序列。整套設(shè)備能支持大約30臺Illumina的測序儀。當(dāng)然，我們還會(huì)擴(kuò)充的。
Q：你們會(huì)長久儲存測序儀所獲得的數(shù)據(jù)嗎?
A：就目前來說，是足夠的，因此你不必在每次開始新一輪測序之前刪除以前的。我們有足夠的容量來儲存。但一個(gè)月之后的情況呢，我不敢說。
Q：能談?wù)凷anger研究院的新一代測序平臺所參與的計(jì)劃嗎?
A：我們正利用Illumina參加Mike Stratton的癌癥基因組計(jì)劃以及大猩猩測序計(jì)劃。Julian Parkhill正用它進(jìn)行高通量的病原體研究。例如，在高度可變的**群體中，任一群體都有很多突變，你很難知道哪個(gè)是真正致病的，但是如果你通覽大量的群體，你就能得到其他方法無法獲得的大量信息。我們主要利用454的儀器進(jìn)行病原體測序。
Q：在使用這些新平臺時(shí)，你們遇到的技術(shù)及數(shù)據(jù)處理上的大挑戰(zhàn)是什么?
A：我想對于用慣了ABI毛細(xì)管測序儀的人們來說，這些新儀器并不是開箱即用的。你不能只是插上插頭，然后就等著在電腦上分析數(shù)據(jù)。它還需要進(jìn)行許多開發(fā)和支持，這是技術(shù)上的挑戰(zhàn)。就數(shù)據(jù)方面而言，近很多人在討論儲存及計(jì)算需求。每個(gè)人都想儲存圖像，讓問題更加惡化。但是我認(rèn)為這個(gè)問題不難解決，你可以投更多的錢去買更多的硬件。當(dāng)然這對小型實(shí)驗(yàn)室來說比較困難。
大的挑戰(zhàn)是去了解如何以優(yōu)的方式提取和分析數(shù)據(jù)，因?yàn)檫@些數(shù)據(jù)我們并不熟悉。例如顏**分、堿基檢出、校準(zhǔn)、數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化這些問題。如果你能解決這些問題中的一部分，我們就能獲得更好的分析技術(shù)，也就能從相同的數(shù)據(jù)中獲得更多更高質(zhì)量的堿基。
另外一個(gè)問題是儀器廠商的品質(zhì)衡量與用戶不一致。人們不知道該使用哪個(gè)判斷閾值(cutoffs threshold)。我們該把判斷閾值設(shè)在哪里，才能得到好的數(shù)據(jù)，但又不拋棄過多的數(shù)據(jù)?這個(gè)問題非常棘手。
David Duggan負(fù)責(zé)TGen的兩個(gè)基因分型中心。他們利用Affymetrix、Illumina、Sequenom和ABI的技術(shù)進(jìn)行著多項(xiàng)基因分型研究。后來，他購買了一臺Illumina的Genome Analyzer，將高通量測序融入了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中。Duggan博士很詳細(xì)地談?wù)摿水?dāng)時(shí)選購GA時(shí)的考慮因素，值得國內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室借鑒。不過，那已是兩年前的事了，目前的選擇又多了很多，還需要大家重新評估。
Q：你為何決定購買Illumina的測序儀?
A：你別忘了，我們是在(2007年)3月做決定的。當(dāng)時(shí)只有454和Illumina兩種選擇。我們也和ABI聯(lián)系過。Helicos也聯(lián)系了我們，談到HeliScope。但我們不想為SOLiD再等9個(gè)月，而HeliScope還需要1年多的時(shí)間。
我們也不是光從便利性考慮。我們很滿意Illumina系統(tǒng)的一些特征。比如說，能夠進(jìn)行1 GB的基因組DNA測序;儀器上的運(yùn)行時(shí)間在3天。HeliScope的預(yù)計(jì)運(yùn)行時(shí)間要長得多。同時(shí)，Illumina的樣品量為0.1-1 mg，與我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。后，一個(gè)很大的因素就是運(yùn)行費(fèi)用。Illumina GA的運(yùn)行費(fèi)用在3000-4000美元，比較合理。就這樣的費(fèi)用而言，除了NIH的撥款，我們還能從其他地方獲得基金。所以，購買GA并是出于某種考慮，而是上述種種因素的綜合。
Q：你能不能給我們例舉一下如何將高通量測序整合到研究中?
A：舉個(gè)例子，我們正在進(jìn)行一個(gè)合作項(xiàng)目，利用tag-SNP方法來篩選52個(gè)候選基因。理想上我希望對部分群體中全部52個(gè)基因進(jìn)行重測序，不僅鑒定出SNP變異體，還有插入和缺失多態(tài)性，然后再根據(jù)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方法來對7200個(gè)樣品進(jìn)行基因分型。它比單獨(dú)的SNP研究更**。
我們設(shè)想的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是，目前，我們是分階段進(jìn)行基因組范圍的研究。在每一個(gè)階段，我們將基因組區(qū)域逐漸縮小。一開始，我們研究4000個(gè)樣品的50萬個(gè)SNP。然后根據(jù)預(yù)算，鑒定前1000個(gè)或幾百個(gè)SNP，并在一個(gè)確認(rèn)的群體中進(jìn)行基因分型。之后在第三階段，我們挑出少數(shù)有意義的SNP，并開始重測序。
而有了新一代測序技術(shù)的高通量，我們不再限制在少數(shù)候選區(qū)域。我們能將管道擴(kuò)寬一些，對幾十個(gè)候選基因區(qū)域進(jìn)行重測序。比如之前的一項(xiàng)研究，他們鑒定出人類基因組上II型糖尿病的十個(gè)致病區(qū)域。每次測序一個(gè)?不，我想一次全部測序。新一代測序技術(shù)也賦予我們這個(gè)能力。它比Sanger測序更便宜，也更高效。
Skolnick博士是Myriad Genetics公司的CSO、技術(shù)奠基人。該公司的發(fā)展戰(zhàn)略是開發(fā)急需的醫(yī)療保健產(chǎn)品，主要涉及腫瘤、老年癡呆癥和抗病毒等幾個(gè)領(lǐng)域。他的研究小組克隆了乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肥胖等**的易感基因。另外，他們還利用Sanger測序和454的Genome Sequencer對葡萄藤和蘋果的基因組進(jìn)行了測序。在，很多測序工作也是圍繞植物展開，那么Skolnick博士的經(jīng)驗(yàn)可能會(huì)有一定的借鑒意義。
Q：你為什么選擇454技術(shù)來進(jìn)行蘋果和葡萄藤項(xiàng)目?
A：當(dāng)時(shí)我們受意大利一所研究院的委托，剛完成了葡萄的項(xiàng)目，并開發(fā)出一種高度自動(dòng)化的引物步移平臺來填補(bǔ)缺口。那時(shí)454剛上市，我們就想454的4倍覆蓋度能夠很好地填補(bǔ)剩余的缺口。實(shí)際上，它完成地非常好，我們也就不需要再進(jìn)行任何引物步移。對于葡萄和蘋果而言，測序都是復(fù)雜的項(xiàng)目，因?yàn)樗鼈兌际欠墙坏奶烊簧?。?fù)雜度在于你實(shí)際上要同時(shí)測兩個(gè)基因組，母本染色體和父本染色體。如果你發(fā)現(xiàn)序列差異，你還必須解釋到底是錯(cuò)誤還是多態(tài)性。
Q：對于蘋果基因組項(xiàng)目，你使用了與葡萄不同的策略。你能談一談這些嗎?
A：在葡萄項(xiàng)目中，我們基本完成了拼接，打算開始引物步移時(shí)，才決定使用454。我們利用了7倍Sanger覆蓋度和4倍454覆蓋度。在蘋果項(xiàng)目中，我們只利用BAC和fosmid完成了4倍Sanger覆蓋度，然后，就加入了10倍454覆蓋度，其中大部分是平均500個(gè)堿基的長讀取?，F(xiàn)在，我們的總覆蓋度是14倍，而不是11倍，因?yàn)橛袃蓚€(gè)染色體，父本和母本，那么每個(gè)多態(tài)性的平均覆蓋度為7倍，在確定兩個(gè)染色體的特定差異上，可靠性是進(jìn)一步增強(qiáng)了。
Q：誰開發(fā)了這些項(xiàng)目的拼接軟件?
A：拼接軟件是由我們小組的Andrey Zharkikh開發(fā)的。拼接程序很獨(dú)特，因?yàn)樗谄唇觾蓚€(gè)不同的單倍體。它將顯示出序列相似性的重疊群(contig)放在一起，同時(shí)，它又試圖將它們分成A、B兩個(gè)染色體。因此，當(dāng)它看到序列差異或缺失時(shí)，它必須詢問“這是我必須修正的錯(cuò)誤嗎?還是我要試圖去理解的真正序列差異?”
有了這種雜合體的拼接策略，你能得到數(shù)百萬個(gè)遺傳標(biāo)記物，非常棒。接著，你能使用它們中的1000或2000或3000的亞群，來進(jìn)行互相定位。于是，你得到了海量的生物學(xué)信息。
Q：你計(jì)劃將拼接軟件與他人共享嗎?
A：當(dāng)然愿意。不過，我們只能克隆Andrey的。它不是一個(gè)真正的程序或產(chǎn)品，它是一系列腳本和代碼片段。我們所能做的是將所有信息告訴454，讓他們在拼接程序中加入這段。將它變成產(chǎn)品需要巨量的工作。那真的超出了我們的范圍。
