Bio-Rad公司推出的EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒(EpiQ chromatin analysis kit )，利用常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之間的差異來(lái)定量評(píng)估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)原位染色質(zhì)消化、基因組DNA純化以及實(shí)時(shí)定量PCR，可以同時(shí)研究幾個(gè)基因啟動(dòng)子的染色質(zhì)狀態(tài)。作為一款新穎的表觀遺傳學(xué)研究工具，EpiQ試劑盒可協(xié)助確定表觀遺傳學(xué)事件(如DNA甲基化和組蛋白修飾)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響。
EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的原理和方法
常染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄活躍的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的位點(diǎn)降解。與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄不活躍的部分，染色深，核酸酶無(wú)法接近，也就不能降解DNA。因此，利用核酸酶消化和QPCR，通過(guò)Cq改變就能評(píng)估染色質(zhì)狀態(tài)。
表觀遺傳學(xué)過(guò)程，如DNA甲基化和組蛋白修飾，通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)控制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄活躍的基因與“開(kāi)放”或“可接近”的染色質(zhì)區(qū)域相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄沉默的基因通常與“關(guān)閉”或“難接近”的染色質(zhì)區(qū)域相關(guān)。
目前定量確定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法較為復(fù)雜，且耗時(shí)長(zhǎng)。它需要從細(xì)胞中分離出細(xì)胞核，并進(jìn)行染色質(zhì)消化，通常需要兩天以上才能完成。Bio-Rad公司推出的EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒(EpiQ chromatin analysis kit )就是利用上面的原理來(lái)定量評(píng)估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)原位染色質(zhì)消化、基因組DNA純化以及實(shí)時(shí)定量PCR，可以同時(shí)研究幾個(gè)基因啟動(dòng)子的染色質(zhì)狀態(tài)。作為一款新穎的表觀遺傳學(xué)研究工具，EpiQ試劑盒可協(xié)助確定表觀遺傳學(xué)事件(如DNA甲基化和組蛋白修飾)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響。有了EpiQ試劑盒，無(wú)需分離細(xì)胞核，6小時(shí)即可獲得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。此外，該試劑盒只需要較少量的細(xì)胞(低至50,000個(gè))就能開(kāi)展分析。
EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的流程如下：在有或沒(méi)有核酸酶的情況下，利用染色質(zhì)緩沖液處理細(xì)胞1小時(shí)(37°C)。利用終止緩沖液來(lái)終止染色質(zhì)消化(37°C，10分鐘)，之后是基因組DNA純化和定量。通過(guò)實(shí)時(shí)定量pcr來(lái)評(píng)估染色質(zhì)結(jié)果，與參照基因比較結(jié)果。
研究人員證實(shí)，EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與多個(gè)細(xì)胞系中一些基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。他們?cè)u(píng)估了四個(gè)不同細(xì)胞系(HeLa、PC3、LNCaP和HCT15)中四個(gè)組成型表達(dá)基因(GAPDH、ACTB、TBP和B2M)的近啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)(下圖A)。每個(gè)基因的啟動(dòng)子都處于開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。同時(shí)評(píng)估了同一細(xì)胞系中11個(gè)表觀遺傳學(xué)調(diào)控的基因啟動(dòng)子(ABCB1、CDH1、CDH13、DAPK1、DKK1、GSTP1、PTGS2、TP73、WT1、p14ARF和p16INK4A)(下圖B)。染色質(zhì)狀態(tài)存在差異，并與基因表達(dá)水平密切相關(guān)。開(kāi)放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域與中等到高水平的基因表達(dá)相關(guān)(右上角黑色框)，而封閉狀態(tài)與低水平相關(guān)(左下角)。EpiQ試劑盒輕松鑒定出PC3細(xì)胞中一個(gè)異常值基因(黑色箭頭)，它表現(xiàn)出一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控的稀有形式—單等位基因甲基化，即只有一個(gè)等位基因被甲基化，導(dǎo)致50%的染色質(zhì)可接近和高水平基因表達(dá)。
確定HIV潛伏的機(jī)制
“我試圖確定病毒蛋白中的突變?nèi)绾斡绊懰c染色質(zhì)重塑因子之間的相互作用。EpiQ試劑盒讓我能夠評(píng)估病毒周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及病毒蛋白是否影響它。”加州大學(xué)伯克利分校的研究生Siddharth Dey說(shuō)。
他在近的實(shí)驗(yàn)中研究了一個(gè)病毒蛋白，它表現(xiàn)出重要的翻譯后修飾，并與多個(gè)細(xì)胞蛋白相互作用。此蛋白中的一些保守位點(diǎn)已鑒定出，對(duì)蛋白功能很關(guān)鍵，如果它們突變，病毒會(huì)變得不起作用。Dey想要研究共同進(jìn)化的位點(diǎn)，即某些位點(diǎn)的氨基酸與其他位點(diǎn)的氨基酸相關(guān)聯(lián)。
他的工作需要用序列比對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)鑒定那些共同進(jìn)化的位點(diǎn)。一旦鑒定出，他就能通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)這些位點(diǎn)。之后再研究它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)或功能上如何重要。
EpiQ試劑盒在這些功能實(shí)驗(yàn)中起了重要作用。研究表明病毒蛋白與多個(gè)細(xì)胞蛋白相互作用，包括SWI/SNF，一個(gè)染色質(zhì)重塑復(fù)合物。
過(guò)去，Dey使用**沉淀來(lái)解決這些問(wèn)題。就目前這項(xiàng)研究以及今后的研究而言，EpiQ試劑盒不能取代**沉淀技術(shù)，而是作為補(bǔ)充。它給出信息，說(shuō)明在哪些條件下需要用染色質(zhì)**沉淀來(lái)進(jìn)一步分析。
Dey希望終能夠完全了解HIV潛伏背后的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)出抗病毒**對(duì)付HIV病毒。
與癌細(xì)胞增殖聯(lián)系起來(lái)
“這個(gè)試劑盒的主要應(yīng)用不太在于發(fā)現(xiàn)什么，而是為了解基因是否表達(dá)提供了一個(gè)捷徑。一旦你了解了這個(gè)，你就能設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，來(lái)更詳細(xì)地了解為什么是這樣，”意大利Insubria大學(xué)結(jié)構(gòu)與功能生物學(xué)系Ian Marc Bonapace教授說(shuō)。
Ian Marc Bonapace教授與一群日本科學(xué)家合作，在上世紀(jì)90年代末發(fā)現(xiàn)了UHRF1蛋白。UHRF1被發(fā)現(xiàn)以后，研究表明它在基因調(diào)控中扮演著重要的角色，它控制著細(xì)胞增殖時(shí)重建正確的DNA和染色質(zhì)修飾的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
Bonapace研究的主要目標(biāo)是確定UHRF1終以何種方式影響了癌癥**。他們認(rèn)為，此蛋白至少能作為癌癥侵襲性的一個(gè)標(biāo)志物。未來(lái)，他們希望能發(fā)現(xiàn)一些阻礙UHRF1活性的分子，這有可能作為一種阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的方法。
在這項(xiàng)研究中，他們使用的主要方法包括染色質(zhì)**沉淀、蛋白抽提和純化，共沉淀和凝膠過(guò)濾，以鑒定此蛋白參與形成了哪些復(fù)合物。在2010年初，Bonapace得到了EpiQ試劑盒。為了檢驗(yàn)它的效果和適用性，他開(kāi)展了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在兩個(gè)不同的前列腺癌細(xì)胞系中比較三個(gè)不同的腫瘤抑制基因。這兩個(gè)細(xì)胞系分別為：非侵襲性的LNCAP和侵襲性的PC3。
Bonapace談到：“這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果正是我們所預(yù)計(jì)的。LNCAP細(xì)胞中腫瘤抑制基因未下調(diào)，而PC3細(xì)胞中則完全下調(diào)(因此染色質(zhì)處于關(guān)閉狀態(tài))。”
Bonapace還談到，在得到EpiQ試劑盒之前，使用染色質(zhì)**沉淀方法來(lái)確定基因是否表達(dá)，一般需要幾天。而使用這個(gè)試劑盒，你能立即確定基因是否被抑制，之后再?zèng)Q定是否要通過(guò)耗時(shí)耗力的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究為什么。Bonapace還介紹了EpiQ試劑盒對(duì)其研究的潛在影響，不但大大節(jié)省時(shí)間，還能有效利用資源，因?yàn)樗粩鄼z測(cè)不同類型的細(xì)胞和腫瘤，看看同一個(gè)目的基因是否受UHRF1蛋白存在或缺失的控制。
